Límite de Endotoxina Bacteriana

LÍMITE DE ENDOTOXINA BACTERINA

Las endotoxinas también conocidas como agentes pirógenos son un componente de la membrana exterior de las bacterias Gram negativas, denominados lipopolisacáridos (LPS), los cuales son moléculas glucolipidicas. Se estima que las bacterias gran negativas poseen alrededor de 3.5×10⁶ moléculas de LPS.

Por lo general, las bacterias en su crecimiento pueden liberar endotoxinas al medio, sin embargo, se ha comprobado que la mayor concentración de endotoxinas se produce durante la lisis celular de las bacterias.

Para la detección de Endotoxinas Bacterianas, la USP 43 (Farmacopea de los Estados Unidos) en el capítulo <85> sugiere tres técnicas: Técnica de coagulación (gel Clot), técnica de turbidimetría y la técnica cromogenica, usando un lisado de amebocitos del cangrejo herradura Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus

Para realizar cualquiera de las tres técnicas mencionadas, es de vital importan que todo el material de vidrio o termoestable se encuentre libre de pirógenos. Para esto, normalmente se utilizan hornos de aire caliente, habitualmente a temperatura e 250 grados durante 30 minutos. Adicionalmente, se deben emplear los materiales de plástico como, por ejemplo, micro-placas y puntas de pipetas se deben usar los que están exentos de endotoxinas detectables de manera que no vayan a interferir en la prueba.

Los reactivos y soluciones de prueba que se deben utilizar según la USP 43 para la realización de la técnica son:

1. Lisado de Amebositos: El cual es un producto liofilizado obtenido a partir de un lisado de amebocitos (leucocitos) del cangrejo herradura. Este lisado va a reaccionar con algunos B-glucanos además de reaccionar con las endotoxinas.

2. Agua para Prueba de Endotoxina Bacteriana (PEB): Se puede utilizar agua para inyección o agua producida siempre y cuando no reaccionen con el lisado empleado.

3. Lisado SR: Se obtiene a partir de disolver el Lisado de Amebositos en Agua PEB.

4. Solución madre de Endotoxina: Se prepara a partir de un estándar de referencia de Endotoxina. El contenido de Endotoxina se expresa en unidades de Endotoxina (UE)

5. Solución estándar de Endotoxina: después de mezclar la Solución Madre del Estándar de Endotoxina se preparan diluciones seriadas de la Solución Estándar de Endotoxina utilizando agua para PEB

Técnica de coagulación: se utiliza para detectar o cuantificar endotoxinas bacterianas por medio de la coagulación del lisado empleado. La concentración mínima de endotoxina que es necesaria para que l técnica de coagulación, es decir para que el lisado se coagule, es la sensibilidad declarada del lisado empleado como reactivo.  El procedimiento se debe llevar a cabo según los lineamientos establecidos por la USP 43.

Técnica Turbidimétrica:  En dicha técnica es una valoración fotométrica que mide los incrementos de turbidez, la cual se puede clasificar como valoración punto final o valoración cinética. La valoración punto final hace referencia a la cuantitativa entre la concentración de endotoxinas y la turbidez de la mezcla de reacción, mientras que la valoración cinética se utiliza para medir el tiempo necesario para alcanzar una absorbancia predeterminada de la mezcla o la velocidad en la que se desarrolla la turbidez.

Técnica Cromogenica: Permite medir el cromóforo liberado de un péptido adecuado por la reacción de las endotoxinas con el lisado. Al igual que la técnica turbidimétrica, se puede clasificar como valoración de punto final o valoración cinética. La valoración cromogenica de punto final se basa en la relación entre la concentración de endotoxinas y la liberación de cromóforo luego de un periodo de incubación, en cuanto a la valoración cromogenica cinética, este método se utiliza para medir el tiempo que tarda en alcanzar una absorbancia predeterminada de la mezcla de reacción o la velocidad en desarrollar color.